一言不合就变性？芦笋要被科学家玩坏了！
植物基因组研究再下一城！这次是芦笋。雌雄异株植物的性别决定机制如何？基因组多倍化与雌雄异株进化又有什么关系？一起来看看新鲜出炉的芦笋基因组研究成果是怎么说的。
文献题目：The asparagusgenome sheds light on the origin and evolution of a young Y chromosome
发表期刊：Nature Communications
发表时间：2017年11月2日
影响因子：12
摘要介绍： 由美国乔治亚大学、江西省农业科院、华大基因、荷兰Limgroup公司、意大利雷焦卡拉布里亚地中海大学、意大利洛迪蔬菜作物研究所CREA、美国唐纳德丹弗斯植物学中心、美国特拉华大学、福建农林大学、荷兰Green Acres Life Science、中科院植物所、荷兰KWS SAAT公司、日本东北大学、中国热带农业科学院、云南农业大学、美国密苏里大学、华中农业大学、美国亚利桑那基因组研究所、意大利巴勒莫生物科学和生物资源研究所等19家单位共同发表了芦笋（Asparagus officinalis）的基因组研究成果。在真核生物系统发育过程中，性染色体是由常染色体多次进化而来。通过对比实验，在组装后的双单倍体芦笋个体中发现了一些与性别决定相关的基因。雌雄异株的植物占被子植物总数的6%，但其基因控制的性别决定机制及性染色体的组成结构仍不十分清楚。雌雄异株植物的进化在被子植物的进化历史中多次独立发生，而在芦笋所属的天门冬属则是近期发生的进化事件，其X与Y染色体具有相同的细胞遗传学特性，只是Y染色体多出一段近1Mb大小的区域。删除这一段序列导致了芦笋从雄性向雌性的转换，而一个雌性发育抑制基因的缺失则可以导致雄性芦笋发育为雌雄同株。
1. 雌雄异株植物的Y染色体基因结构研究及性别决定机制；
2. 基因组多倍化与雌雄异株进化的关系。
1. 结合二、三代测序技术，利用BioNano光学图谱技术辅助基因组组装。
2. 利用射线/自然突变株样本研究雄性-雌雄转换和雄性-雌雄同株转换过程中Y染色体非重组区域的基因结构。
3.利用花药离体培养构建了77个双单倍体组成的群体，用于构建遗传图谱。
1.通过花药离体培养获取双单倍体的芦笋植株（DH00/086）；
2.由一组XX和YY亲本构建的77个个体的作图群体（包含74个XX或YY双单倍体子代）；
3.不同发育阶段的芦笋不同组织样本。
基因组图谱：
二代测序采用Illumina平台，共完成341Gb数据，包含短插入片段文库（170bp，200bp，500bp，800bp，2k），mate-pair文库（5K，10k，20k，40k）。
三代测序采用PacBio RSII平台，共完成6.07Gb数据。
最终二三代联合组装Scaffold N50为303kb，ContigN50为88Kb。
利用BioNano光学图谱完成了88Gb数据。
群体重测序：
采用Illumina平台对77个个体进行3.5x低深度测序，文库插入片段为700bp。
所用软件与数据库：
SOAPdenovo2用于二代数据组装，再用GapCloser用于补洞，SSPACE用于scaffolding，最后通过PBJelly2使用三代数据进行补洞。基于群体重测序构建遗传图谱，把scaffolds定位到10个连锁群上，同时再用optical mapping的测序数据对遗传图谱的组装结果进行验证和纠错。BWA用于比对，Samtools用于数据整合和SNP calling，IrysView用于BioNano数据组装，LTRharvest和RepeatClassifier用于LTR注释，Trinity用于转录组组装，Exonerate用于转录组数据比较，CEGMA和BUSCO Plant Gene databases用于评估基因组组装和注释效果，Evidence Modeler用于基因集整合，LAST用于预测基因比对，ASTRAL、PUG用于系统发育与基因组重复分析，Bowtie用于Small RNA比对，miREAP和CentroidFold用于Small RNA鉴定。
1. 基因组组装与Y染色体的注释
利用一个离体花药培养的双单倍体样本（DH YY）完成了1.3Gb的芦笋基因组组装。结合二代、三代测序数据以及BioNano光学图谱技术，并利用一个77个个体的作图群体完成了遗传图谱，最终超过93%的组装数据挂上染色体。图1展示了将组装结果（绿色）map到光学图谱（蓝色）上的大致结果。
图1 初步组装的scaffolds比对至光学图谱结果
其中在132Mb的Y染色体上，发现了一段近1Mb长位于非重组区的性别决定区。该区域中预测出的13个基因中的12个在XX雌性中丢失。表1展示了13个基因，图2展示了其中7个基因（红点）在连续的组装区域上的分布。
表1 Y染色体上的13个非重组区基因的注释
图2 通过组装contigs与光学图谱的比对展示Y染色体的非编码区
在这些Y染色体特异基因中，TDF1在其它物种中也被同样发现。TDF1敲除的拟南芥中雌性器官可以正常发育，但不能产生正常的花粉。在XX雌性芦笋中，在花粉形成前很短时间花药就终止发育了，表现为小孢子转录进程终止。通过拟南芥中基因敲除导致的雄性不育性状，单拷贝的TDF1基因在芦笋中也是一个重要的促进雄性发育的候选基因。
2. 雄性到雌性的转换
使用钴-60对XX和YY亲本杂交得到的XY子代种子进行伽马辐射并种植。选择结种的雌株进行微卫星标记的检测，确保其为XY型杂交后代。对符合条件的只结雌花的三个子代进行10x的基因组测序，所有三个突变株Y染色体上的非重组区都被独立地删除了。这符合文章的预测：在雄性植株中，Y染色体的非重组区包含所有对于性别决定所必须的基因。这些Y染色体上缺失的区域编码了一个或多个决定雌性发育抑制或促进雄性功能的因子。
3. 单雄性到雌雄同株的转换
在射线突变体中发现了一株开两性花的个体。重测序发现一个Y染色体特有的DUF247 domain包含的基因发生了局部的基因缺失。在另外一个独立的芦笋品系中也发现了一个自发的雄性转化为两性花的个体。对该个体进行转录组测序发现该Y染色体连锁的DUF247 domain发生了一个移码突变，这个突变导致了雄性向两性的转换。这两个独立的突变事件显示了Y染色体特异的DUF247基因对雌性抑制其关键作用，这个基因命名为SOFF。
如图3，A图展示了在SOFF和TDF1两个基因models上，雄性XY野生型、雌性XX与伽马射线处理的三个样本的比对的转录组reads数。B图展示了野生型的雌花、雄花与一个雄性-雌雄两性自然突变体的花的对比，其中该突变体的SOFF基因发生了一个移码突变。根据两基因模型中雌雄异株的起源观点，两个雌雄同株的突变体都没有显示出花药发育遭到破坏，暗示至少还有另一个Y染色体特异的基因在促进雄性功能。根据前面提到的，如果想要假设TDF1基因是一个重要的雄性功能促进基因，将来就要检测是否将TDF1引入XX基因型后会帮助芦笋从雌性转换为两性花的植株并正常发育。
图3 Y染色体上的两个性别决定基因的突变
4. SmallRNA显示了性别差异表达
对比芦笋雌雄植株营养组织和生殖组织不同样品的small RNA发现不同性别的植株具有不同的sRNA模型。但没有基因来自Y染色体的非重组区。文章完成了15个SmallRNA测序，分别来自根，茎，叶，雌性和雄性花的早晚期组织，具有三种不同基因型的雌性、雄性、超雄性的叶片组织等。文章鉴定了18-36nt长度的RNA，并计算了在不同组织样本中sRNAs的分度分布（见图4）。图中横轴为sRNAs tags大小，纵轴为标准化后的丰度值。不同颜色表示比对至基因组的不同区域。
图4 芦笋不同组织中sRNA大小和丰度分布
6个sRNAs始终在雄性植株嫩茎中有表达偏向性（见图5。B图展示了XY雄性和XX雌性芦笋嫩茎组织在三种基因型（8A、8B、10）中miRNAs不同的表达模式，红色表示在雄性嫩茎中富集，绿色表示雌雄偏向性的表达。）
图5 miRNA在雌雄植株不同组织中的表达多样性
5. 进化进程中性别决定区域的变异
天门冬属包含超过200个种，其中绝大部分是雌雄同株的植物。先前的研究表明雌雄异株的类群集中在系统发育树的一支当中。为了研究SOFF和TDF1基因是否在天门冬属雌雄异株植物中均以雄性特异的性别决定基因发挥作用，文章对一组XY雄性和XX雌性天门冬（A. cochinchinensis）、雌雄同株的扫状天门冬（A. virgatus）进行重测序。基于DUF247基因的同源分析，天门冬与芦笋都在1号内含子区域具有较长的开放阅读框，且基于三个物种的SOFF与DUF247基因的系统发育分析推测天门冬与芦笋的SOFF基因直系同源。这暗示了基因复制事件为雌性功能抑制与雌雄异株起源创造了条件。
6. 多倍化事件的发生先于雌雄异株出现
天门冬属中雌雄异株植物的基因组大小几乎二倍于雌雄同株植物。之前有推测这来源于转座子的累积。但是文章组装后的基因组的共线性分析却揭示了至少两次基因组加倍化的证据。系统发育分析证明天门冬属的雌雄异体化是经过了一到两次进化而形成，同时伴随着基因组大小和重复序列的增加。其分布区域也从非洲南部扩展到了北部及欧洲。通过X与Y染色体在细胞遗传学上的同形性与超雄性基因型（YY）能够产生可育花粉，推测天门冬属的雌雄异体与性染色体均为近期起源的。芦笋在花芽发育初期是同时具有雌雄器官的，而在雄株的雌蕊终止发育和雌株的花药开始退化时才体现出差异，进一步证明了“两基因决定系统”在其中发挥的作用。天门冬属植物的Y染色体的进化受到雌性抑制基因的复制和随后的非重组性染色体决定区域的扩张的调节，而这与两基因模型一致。
参考文献
Alex Harkess et al., Theasparagus genome sheds light on the origin and evolution of a young Ychromosome. Nature Communications (2017).
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撰稿：孙海陆
编辑：市场部
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